Tobey Maguire esittää jälleen sävyisää, kaksoiselämää viettävää Peter Parkeria, joka joutuu tasapainottelemaan kahta rooliaan opiskelijana ja rikollisia taltuttavana supersankarina. Peterin elämä hankaloituu entisestään, kun hän kohtaa uuden vihollisensa, nerokkaan tiedemiehen Otto Octaviuksen (Alfred Molina), joka on syntynyt uudelleen hulluna, monilonkeroisena Tohtori Mustekalana. Kun Tri Mustekala kidnappaa MJ:n (Kirsten Dunst), Hämähäkkimiehen on ryhdyttävä tositoimiin, ja seikkailu saa uusia, ennennäkemättömän jännittäviä ulottuvuuksia. Sisältää myös version Spider-Man 2.1, jossa on kahdeksan minuuttia lisäotoksia.